Electrophysiologie des Membranes

Régénération du latex et systèmes de transport membranaire chez les laticifères Hevea brasiliensis.

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Nous avons développé une approche cellulaire du système responsable de la synthèse du caoutchouc : le laticifère. La culture de cette plante, productrice de caoutchouc naturel, est d’une importance majeure pour l’économie de nombreux états subtropicaux. Ce travail a été mené en étroite collaboration avec l’équipe de J.L. Jacob du CIRAD-CP(Montpellier).
    Ce travail a consisté à adapter des approches électrophysiologiques à l'étude in situ et in vitro du laticifère, puis à analyser le fonctionnement d'un certain nombre de transporteurs membranaires susceptibles d'être impliqués in planta dans la régénération du latex qui suit la saignée du tronc, mode de récolte du caoutchouc. Ce matériel original n'avait jusque là jamais été étudié par des techniques électrophysiologiques, qui permettent d'accéder au fonctionnement des transporteurs membranaires dans un environnement tissulaire.
    Le réseau laticifère est constitué de cellules du phloème anastomosées, peu vacuolées, dépourvues de plasmodesmes, et donc isolées du reste du symplasme. Le fonctionnement des transporteurs de leur membrane plasmique revêt une importance cruciale puisqu'il peut affecter la régénération du latex (ou cytosol) et donc limiter la production de caoutchouc. En effet, la saignée du tronc engendre un stress hydrique et osmotique important, dû à l’expulsion d’une partie du latex. Le laticifère, pour régénérer son latex, devient alors un puits de première importance pour l’absorption d’éléments tant minéraux qu’organiques.
     Dans un premier temps nous nous sommes intéressés aux mécanismes membranaires participant à l’absorption du saccharose, précurseur du caoutchouc. Le saccharose est obligatoirement d'origine exogène car le laticifère ne photosynthétise pas et ne possède pas de réserves de sucres.
    Nous avons mis en évidence, par des techniques électrophysiologiques et l'utilisation d’inhibiteurs spécifiques, l'effet dépolarisant de symports H+/saccharose et/ou H+/glucose. Leur activité dépend de celle de la pompe à H+ plasmalemmique (modifiée par des inhibiteurs spécifiques ou des inhibiteurs métaboliques). Ces résultats ont été confirmés à l'aide d'électrodes sélectives à H+, qui ont permis de montrer que l'influx couplé de H+ et des sucres alcalinise l'apoplasme (Bouteau et al. 1991). Par ailleurs, nous avons montré que l’éthylène, hormone de stress connue pour favoriser la biosynthèse du caoutchouc, stimule l'activité de la pompe à H+ des laticifères, et augmente le gradient de H+ favorable aux cotransports (Bouteau et al. 1991). Cette hormone est couramment utilisée en plantation pour augmenter la production.
    L'électrogénicité des symports ne donnant pas d'indications qualitatives sur l’absorption des sucres (déplacement d’une charge électrique au travers de la membrane, couplé au transport du sucre neutre), nous avons vérifié, grâce à des sucres marqués au 14C, que le laticifère excisé accumule le saccharose et le glucose, comme celui de l'arbre intact. Pour vérifier la capacité du laticifère à absorber le saccharose, et il a fallut écarter l'intervention possible d'une invertase pariétale, et pour cela nous avons travaillé sur des protoplastes de laticifères. Nous avons mis au point une méthode d'isolement des réseaux de laticifères par digestion enzymatique. Leurs protoplastes sont atypiques: ils restent anastomosés en réseau, alors que les protoplastes des autres cellules végétales sont classiquement sphériques et séparés. Nous avons vérifié par autoradiographie que ce matériel original conserve la capacité à absorber le 14C-saccharose, le 14C-fructose et le 14C-glucose. L'influx de ces sucres étant sensible aux inhibiteurs du symport H+/saccharose (phloridzine), de la pompe à H+ (vanadate) et aux protonophores (DNP), il est probable qu'il résulte du fonctionnement de symports H+/sucres.
    Des expériences complémentaires d’électrophysiologie ont permis de confirmer l'intervention du symport H+/saccharose chez les protoplastes de laticifères (Bouteau et al. 1993) et d'évaluer l'ordre de grandeur de sa constante d'affinité pour le saccharose, soit environ 1 mM (Bouteau et al. 1999).
     Nous nous sommes aussi intéressé aux systèmes membranaires responsables des mouvements de K+, ion majeur du cytoplasme intervenant de façon très précoce dans le processus de régénération du latex chez les arbres en exploitation.
Grâce aux électrodes sélectives au K+ et aux mesures de courants en voltage imposé (système à mono-électrode), nous avons démontré la part prépondérante des flux de K+ dans le maintien du potentiel de membrane, au repos, chez les laticifères dans le tissu.
    Chez les protoplastes, des courants K+ entrants et sortants ont pu être enregistrés. Les premiers présentent des caractéristiques similaires à celles observées pour les canaux K+ entrants rectifiants des autres cellules végétales : activation en réponse à une hyperpolarisation de la membrane pour des concentrations de KCl > 0,1 mM, dépendance vis-à-vis du temps, sensibilité au baryum et au tetraéthylammonium (TEA), deux inhibiteurs de canaux K+. Le seuil d’activation de ces canaux semble dépendre du potentiel d’équilibre du K+. Une telle régulation fait que ces canaux ne s'ouvrent que lorsque les conditions (potentiel de membrane et gradient de K+) autorisent l’absorption de K+. Elles sont réunies lorsque la stimulation de la pompe à H+ hyperpolarise la membrane, permettant d'atteindre le seuil d’activation de ces canaux et d'entraîner l'influx de K+ (Bouteau et al. 1996).
    Les courants sortants présentent eux aussi des caractéristiques comparables à celles des canaux K+ sortants rectifiants d'autres cellules végétales: activation en réponse à une dépolarisation, dépendance vis-à-vis du temps, sensibilité au baryum. Ces canaux semblent aussi être dépendants du Ca2+ cytosolique (sensibilité au Ca2+ externe et à l'érythrosine B, bloqueur des pompes d'excrétion de Ca2+) (Bouteau et al. 1996). Par contre, à la différence des autres cellules végétales, les canaux K+ sortants des laticifères peuvent s’inactiver rapidement dans certaines conditions (K+ interne faible). Cette caractéristique, associée à leur seuil d’activation positif, suggère leur implication dans la perception et la transduction d’un signal de type potentiel d’action (l’intervention d'un tel signal est probable in planta après la saignée, car il est induit par les stress mécaniques chez les plantes).
     En conclusion : à la suite du stress de saignée, lors des phases précoces de régénération du latex, la séquence d'intervention des différents transporteurs membranaires des laticifères peut être envisagée comme suit : (i) activation des canaux K+ sortants pour la régulation du potentiel membranaire, peut-être en réponse à un signal de type potentiel d'action, (ii) stimulation de la pompe à H+ par l'éthylène endogène synthétisé en réponse à la blessure, (iii) influx de K+ via les canaux K+ entrants et stimulation des symports H+/sucres, nécessaire à la synthèse du caoutchouc, en réponse à l'hyperpolarisation due à la pompe à H+.

1991 BOUTEAU F., LACROTTE R., CORNEL D., MONESTIEZ M., BOUSQUET U., PENNARUN A.M and RONA J.P. Electrogenic active proton pump in Hevea brasiliensis laticiferous cells: Its role in activating glucose/H+ and sucrose/H+ symports at the plasma membrane. J. Electroanal. Chem., 321: 223-236.

1992 BOUTEAU F., BOUSQUET U., LACROTTE R., CORNEL D., MONESTIEZ M., and RONA J.P. Sucrose/H+ and glucose/H+ symports at the plasma membrane of laticiferous cells and protoplasts of Hevea brasiliensis. Ind. Jour. Nat. Rub. Reasearch, 5: 25-37.

1993 BOUTEAU F., PERINO C., CORNEL D. and RONA J.P. Potassium channels and sugars absorption in protoplasts of Hevea brasiliensis laticiferous vessels. Bioelectrochem. Bioenerg., 31: 215-228.

1996 BOUTEAU F., BOUSQUET U., PENNARUN A.M., CONVERT M., DELLIS O., CORNEL D. and RONA J.P. Time dependent K+ currents through plasmalemma of laticiferous vessel protoplasts from Hevea brasiliensis. Physiol. Plant., 98: 97-104.

1999 BOUTEAU F., DELLIS O., BOUSQUET U. et RONA J.P. Evidence of multiple sugar uptake across the plasma membrane of laticifer protoplasts from Hevea. Bioelectrochem. Bioenerg., 48: 135-139.

BOUTEAU F., DELLIS O. and RONA J.P. 1999. Transient outward K+ currents through plasma membrane of laticifer from Hevea brasiliensis. FEBS Letters : 17, 458 (2) 185-187.

Chapitre d'ouvrage

1993 D'AUZAC J., BOUTEAU F., CHRESTIN H., JACOB J.L., LACROTTE R., PREVOT J.C., PUJADE-RENAUD V., RONA J.P. and CLEMENT A. Stress ethylene in Hevea brasiliensis: physiological, cellular and molecular aspects. In : Cellular and Molecular Aspects of the Plant Hormone Ethylene, Current Plant Science and Biotechnologie in Agriculture, PECH J.C., LATCHE A. and BALAGUE C., eds. KLUWER ACADEMIC PUBHISHERS, vol. 16, pp205-210.

Autres publications.

1990 LACROTTE R., MONESTIEZ M., CORNEL D., BOUTEAU F. and RONA J.P. Loading mechanisms of laticiferous cells by an electrophysiological method. In: Physiology & Exploitation of Hevea brasiliensis, Ed Kunming, Chine, 3: 26-41.

1992 BOUTEAU F., LACROTTE R. and RONA J.P. Sugars uptake and K+ transport at the plasma membrane of laticiferous vessels and protoplasts of Hevea brasiliensis. Life Sci. Adv. (Plant Physiology), 11: 33-44.

1992 JACOB J.L., D'AUZAC J., PREVOT J.C., LACROTTE R., CLEMENT A, SISWANTO, PUJADE-RENAUD V., CHRESTIN H., BOUTEAU F. and RONA J.P. Ethylene stress: Influence on laticifer functioning and yield. In : International Meeting of the Institut of Rubber Research and Developpement Board, Jakkarta, Indonésie, pp. 25.

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